非洲豬瘟試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

非洲豬瘟試劑盒又稱(chēng)非洲豬瘟核酸病毒熒光PCR試劑盒，非洲豬瘟試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理，可用于檢測豬血液、淋巴結、脾臟、扁桃體等樣本中非洲豬瘟病毒的檢測。

（快提核酸擴增試劑盒）

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名稱(chēng)：非洲豬瘟試劑盒（PCR熒光探針?lè )ǎ? 英文名稱(chēng)：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預期用途］

本試劑盒主要用于檢測疑似感染豬抗凝血及臨床病料中的非洲豬瘟病毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適用于非洲豬瘟病毒的檢測、輔助診斷和流行病學(xué)調查。

【試劑盒組分】

1、試劑盒組成及貯藏條件

2、需自備材料：生理鹽水、無(wú)菌槍頭、熒光PCR專(zhuān)用反應管、記號筆等。

【操作步驟】一、樣品制備

1、血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為EDTA）或血清樣品，編號備用。

2、組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒大?。?，眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加1mL生理鹽水混勻，4°C條件下8000rpm/分鐘離心2分鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號備用。

二、DNA提取

取反應液A 20μL分別加入到新的1.5mL離心管，加入抗凝而或血清或組織上清液2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘，加入反應液B 20μL,吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需8000rpm/分鐘再離心2分鐘后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴增

1、配液：取出PCR反應液、酶混合液，在室溫完全融化后，充分混勻，瞬離，可將酶混合液全部取岀直接加入到PCR反應液中，充分混勻，瞬離后按每份20μL分裝使用；或按照每份PCR反應液17μL,酶混合液3μL的比例取一定的試驗用量，混合兩種反應液,瞬離后按照每份20μL分裝到專(zhuān)用熒光PCR 反應管中，剩余試劑立即凍存；（操作過(guò)程要注意避光）

2、加樣擴增：分別向上述PCR反應管中加入5μL樣本 DNA或陰性對照或陽(yáng)性對照，混勻并瞬離,放入熒光PCR儀上運行以下程序：

步驟 條件 循環(huán)數 UNG處理 50°C：2分鐘1 預變性 95°C：3分鐘1 預擴増 95°C：8秒55C：8秒5 PCR擴增 95°C：8秒55°C：8秒40

熒光通道選擇FAM,在40循環(huán)階段每個(gè)循壞的55°C時(shí)收集熒光信號。設置擴增體系為25μL,同時(shí)要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。

(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說(shuō)明書(shū)中的反應程序設置后因持溫時(shí)間短無(wú)法運行,可將預擴增和PCR擴增條件變更為95°C：5秒55°C：30秒。)

【結果判定】1、基線(xiàn)和閾值設定；基線(xiàn)調整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號，閾值設定以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)陰性對照檢測熒光曲線(xiàn)的最高點(diǎn)為原則。

2、質(zhì)量控制：反應結束后，陰性對照的檢測結果應無(wú)特定的擴增曲線(xiàn)，Ct值為＞38或無(wú)；陽(yáng)性對照 的Ct值應≤30.0,且明顯的擴增曲線(xiàn)；否則實(shí)驗視為無(wú)效。

3、樣品判定：待檢樣品熒光信號有指數型增加，且結果顯示Ct值<35.0,報告為陽(yáng)性；未檢測到Ct 值或Ct值＞38或無(wú)明顯擴增曲線(xiàn)，則樣品判定為陰性。35≤Ct值≤8時(shí)，復檢一次，重復結果為陽(yáng)性者判定為陽(yáng)性，否則判定為陰性。

【注意事項】1、實(shí)驗前請仔細閱讀本試劑盒說(shuō)明書(shū)，嚴格按照操作步驟執行，在操作過(guò)程中對時(shí)間、試劑體積等精確控制可以獲得最好的結果。

2、實(shí)驗室應嚴格按照有關(guān)規定分區管理。各區間人員、器材、試劑及空氣流向應有產(chǎn)格要求。

3、有關(guān)耗材確保潔凈、無(wú)菌，核酸提取完成后盡快進(jìn)入下一步試驗或冷凍保存。

4、預混后的試劑應盡量在短期內使用完畢，戶(hù)外使用應在加冰袋的泡沫盒保存，每日試驗完畢應及時(shí)冷凍保存。

5、對于熒光PCR管要避免徒手或使用過(guò)的手套接觸，檢測過(guò)程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

6、凍存試劑使用前應于室溫下完全融化，充分混勻，瞬時(shí)離心使液體完全沉于管底。

7、樣品、陰性對照封蓋后，在通風(fēng)環(huán)境添加陽(yáng)性對照并及時(shí)封蓋，避免組分間及氣溶膠等假陽(yáng)性污染。

8、擴增反應完畢后的PCR管?chē)澜_(kāi)蓋,應和試驗產(chǎn)生的其它廢棄物一起及時(shí)收集,遠離PCR實(shí)驗室進(jìn)行無(wú)害化處理。

【規格】50頭份/盒。

【貯藏與有效期】-20°C以下避光保存，有效期12個(gè)月。

僅供獸醫診斷使用